Прегабалин не является агонистом ГАМК или ГАМК-рецепторов.
Прегабалин представляет собой габапентиноид и действует путем ингибирования определенных кальциевых каналов. В частности, он является лигандом вспомогательного участка субъединицы α2δ некоторых потенциал-зависимых кальциевых каналов (VDCC) и, таким образом, действует как ингибитор VDCC, содержащих субъединицу α2δ. Существуют две субъединицы α2δ, связывающие лекарственное средство, α2δ-1 и α2δ-2, и прегабалин демонстрирует одинаковое сродство к этим двум сайтам (и, следовательно, отсутствие селективности между ними). Прегабалин избирательно связывается с субъединицей α2δ VDCC. Несмотря на то, что прегабалин является аналогом ГАМК, он не связывается с ГАМК-рецепторами, не превращается в ГАМК или другой агонист ГАМК-рецепторов in vivo и не модулирует напрямую транспорт или метаболизм ГАМК. Однако было обнаружено, что прегабалин вызывает дозозависимое увеличение экспрессии в мозге декарбоксилазы L-глутаминовой кислоты (GAD), фермента, ответственного за синтез ГАМК, и, следовательно, может оказывать некоторые косвенные ГАМКергические эффекты за счет повышения уровня ГАМК в мозге. В настоящее время нет доказательств того, что эффекты прегабалина опосредованы каким-либо иным механизмом, кроме ингибирования α2δ-содержащих VDCC. Соответственно, ингибирование VDCC, содержащих α2δ-1, прегабалином, по-видимому, ответственно за его противосудорожное, анальгезирующее и анксиолитическое действие.
Эндогенные α-аминокислоты L-лейцин и L-изолейцин, которые по химической структуре очень напоминают прегабалин и другие габапентиноиды, являются очевидными лигандами субъединицы α2δ VDCC с таким же сродством, как и габапентиноиды (например, IC50 = 71 нМ для L- изолейцин) и присутствуют в спинномозговой жидкости человека в микромолярных концентрациях (например, 12,9 мкМ для L-лейцина, 4,8 мкМ для L-изолейцина). Было высказано предположение, что они могут быть эндогенными лигандами субъединицы и могут конкурентно противодействовать эффектам габапентиноидов. Соответственно, хотя габапентиноиды, такие как прегабалин и габапентин, обладают наномолярным сродством к субъединице α2δ, их эффективность in vivo находится в низкомикромолярном диапазоне, и считается, что конкуренция за связывание с эндогенными L-аминокислотами, вероятно, является причиной этого несоответствия.

В одном исследовании было обнаружено, что прегабалин обладает в 6 раз более высоким сродством, чем габапентин, к VDCC, содержащим субъединицу α2δ. Однако другое исследование показало, что прегабалин и габапентин обладают сходным сродством к рекомбинантной субъединице α2δ-1 человека (Ki = 32 нМ и 40 нМ соответственно). В любом случае прегабалин в 2–4 раза более эффективен, чем габапентин, как анальгетик, а у животных в 3–10 раз более эффективен, чем габапентин, как противосудорожное средство.